糞大腸菌群是總大腸菌群的一部分，又稱耐熱大腸菌群。生長(zhǎng)于人與部分動(dòng)物體內(nèi)腸道中，水體中的糞大腸菌群主要來(lái)自糞便污染，因此通過測(cè)定水中糞大腸菌群的含量，可間接得出水體受糞便污染的情況，在環(huán)境監(jiān)測(cè)和衛(wèi)生防疫方面具有重要意義
 

　　本文對(duì)比三種不同糞大腸菌群的檢測(cè)方法，通過比較多管發(fā)酵法、紙片快速法和酶底物法的檢測(cè)結(jié)果，討論酶底物法檢測(cè)糞大腸菌群的可行性及應(yīng)用。
 

　　一、檢測(cè)方法及原理
 

　　1、多管發(fā)酵法
 

　　將水樣接種于乳糖蛋白胨培養(yǎng)基的發(fā)酵管中，在37±0.5℃下培養(yǎng)24±2 h進(jìn)行初發(fā)酵試驗(yàn)，大腸菌群生長(zhǎng)繁殖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，產(chǎn)酸使乳糖蛋白胨培養(yǎng)液中的p H降低，發(fā)酵管由紫色變黃色;產(chǎn)氣使發(fā)酵管中導(dǎo)管產(chǎn)生小氣泡，產(chǎn)酸或產(chǎn)氣則為陽(yáng)性，否則為陰性。
 

　　將顯陽(yáng)性的發(fā)酵管接種至EC培養(yǎng)液，在44.5±0.5℃下培養(yǎng)24±2 h進(jìn)行復(fù)發(fā)酵，造成不利于自然環(huán)境中的大腸桿菌生長(zhǎng)的條件，而糞大腸菌群將會(huì)在44.5℃下繼續(xù)存活生長(zhǎng)繁殖，由此通過復(fù)發(fā)酵管中產(chǎn)氣情況判定陽(yáng)性。
 

　　通過復(fù)發(fā)酵后顯陽(yáng)性的發(fā)酵管數(shù)，查詢MPN表，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)算出糞大腸菌群濃度。
 

　　2、紙片快速法
 

　　通過將水樣接種于吸附了溴甲酚紫和2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑 (TTC) 以及乳糖等營(yíng)養(yǎng)成分的無(wú)菌濾紙上，在44.5±0.5℃下培養(yǎng)18～24 h，當(dāng)糞大腸菌繁殖產(chǎn)酸使溴甲酚紫變黃色，產(chǎn)氣使相應(yīng)的脫氫酶催化底物TTC形成紅色的不溶性三苯甲臢 (TTF) ，在黃色背景顯示出紅色的斑點(diǎn)或紅暈，判定糞大腸菌群存在，該接種紙片顯陽(yáng)性，通過查詢MPN表計(jì)算出相應(yīng)濃度值。
 

　　3、酶底物法
 

　　將已加入培養(yǎng)基的水樣混勻與97孔定量盤，置于44.5±0.5℃培養(yǎng)24h，糞大腸菌能在該溫度產(chǎn)生β-半乳糖苷酶 (β-D-galactosidase) ，分解選擇性培養(yǎng)基中的鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖 (ONPG) 生成黃色的鄰硝基beng酚，通過定量盤大小孔顯黃色數(shù)查詢酶底物法的MPN表，計(jì)算出糞大腸菌群的濃度。
 

　　二、實(shí)驗(yàn)步驟
 

　　根據(jù)水樣污染程度選擇不同的稀釋倍數(shù)，將水樣接種于乳糖蛋白胨培養(yǎng)基的發(fā)酵管中，在37±0.5℃下培養(yǎng)24±2 h進(jìn)行初發(fā)酵試驗(yàn)，產(chǎn)酸產(chǎn)氣顯陽(yáng)性;將顯陽(yáng)性的發(fā)酵管用3 mm接種環(huán)接種至EC培養(yǎng)液，在44.5±0.5℃下培養(yǎng)24±2 h進(jìn)行復(fù)發(fā)酵，發(fā)酵管內(nèi)小導(dǎo)管有氣泡則顯陽(yáng)性，記錄陽(yáng)性管數(shù)，查對(duì)應(yīng)MPN表，計(jì)算結(jié)果。
 

　　1、紙片快速法
 

　　根據(jù)水樣污染程度，樣品按照三個(gè)10倍遞減的不同接種量接種，每個(gè)接種量分別接種5張紙片，共接種15張紙片。接種水樣應(yīng)均勻滴加在紙片上，紙片充分浸潤(rùn)、吸收水樣，用手在聚丙烯塑膜袋外側(cè)輕輕撫平，做好標(biāo)記。接種后立即放置44.5±0.5℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h后，通過紙片上顏色變化判定陽(yáng)性紙片數(shù)，查詢對(duì)應(yīng)MPN表，計(jì)算結(jié)果。
 

　　2、酶底物法
 

　　根據(jù)水樣受污染程度，進(jìn)行樣品稀釋，將商品化酶底物培養(yǎng)基加入100 ml待測(cè)樣品中，充分混勻，*溶解后全部倒入97孔定量盤中，撫平定量盤背面，趕出氣泡，用程控定量封口機(jī)封口。放置于44.5±0.5℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后于標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性比色盤對(duì)比，根據(jù)陽(yáng)性孔數(shù)查詢對(duì)應(yīng)的MPN表，計(jì)算結(jié)果。
 

　　三、結(jié)果與討論
 

　　1、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與數(shù)據(jù)分析
 

　　實(shí)驗(yàn)開始前對(duì)使用的玻璃器皿按要求進(jìn)行滅菌操作，制備無(wú)菌水時(shí)檢驗(yàn)純水質(zhì)量并進(jìn)行滅菌操作，并開啟實(shí)驗(yàn)室紫外燈對(duì)細(xì)菌室滅菌2 h以上。
 

　　根據(jù)方法標(biāo)準(zhǔn)和《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法 (第四版) 》要求，分別用滅菌水對(duì)每批次樣品培養(yǎng)基 (培養(yǎng)紙片) 進(jìn)行全程序空白和實(shí)驗(yàn)室空白檢驗(yàn)，均未檢出，亦無(wú)任何顏色或氣泡等明顯變化。
 

　　每次實(shí)驗(yàn)均用大腸埃希氏菌和產(chǎn)氣腸桿菌做陽(yáng)性、陰性對(duì)照，且大腸埃希氏菌對(duì)照組樣品均顯陽(yáng)性，產(chǎn)氣腸桿菌對(duì)照組均顯陰性。



 

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